PCR, electroforesis y enzimas de restricción: técnicas básicas de biotecnología

Introducción

La biotecnología utiliza organismos o sus moléculas para obtener productos útiles: insulina humana producida por bacterias, pruebas de paternidad, diagnóstico de virus o cultivos resistentes a plagas. Detrás de casi todo ello están tres técnicas básicas del laboratorio: la PCR (copiar ADN), la electroforesis (separar fragmentos por tamaño) y las enzimas de restricción con la ingeniería genética (cortar y pegar ADN).

En este artículo entenderás cómo funciona cada técnica y resolverás cinco problemas típicos de examen. Para repasar la estructura del ADN y su copia, mira ADN, ARN y flujo de la información genética, y para las enzimas, ¿Cómo actúa un enzima?.

1. La PCR: fotocopiadora de ADN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fabrica millones de copias de un fragmento concreto de ADN a partir de una cantidad mínima. Necesita ADN molde, dos cebadores (pequeños fragmentos de ADN que flanquean la zona de interés), nucleótidos libres y una ADN polimerasa termoestable (la Taq, de la bacteria Thermus aquaticus, que resiste altas temperaturas). Se repite un ciclo de tres pasos:

1. Desnaturalización (≈ 94 °C): se rompen los puentes de hidrógeno y se separan las dos cadenas.
2. Anillamiento (≈ 50–60 °C): los cebadores se unen a sus secuencias complementarias.
3. Extensión (≈ 72 °C): la polimerasa añade nucleótidos y completa la cadena nueva.

Perfil térmico de dos ciclos de PCR.

Como cada ciclo duplica las moléculas, tras $n$ ciclos habrá $N = N_0 \cdot 2^n$ copias del fragmento.

2. Electroforesis en gel

La electroforesis separa fragmentos de ADN según su tamaño. El ADN tiene carga negativa (por los grupos fosfato), de modo que en un gel de agarosa sometido a un campo eléctrico migra hacia el polo positivo; los fragmentos pequeños avanzan más deprisa que los grandes. Se tiñe el ADN con un colorante fluorescente y se compara con un marcador de tamaños conocidos.

3. Enzimas de restricción y clonación

Las enzimas de restricción son proteínas bacterianas que cortan el ADN en secuencias concretas (sitios de restricción), normalmente palíndromos de 4 a 8 bases. La EcoRI, por ejemplo, corta entre la G y la A de la secuencia GAATTC y deja extremos «pegajosos» complementarios. Si se corta un gen y un plásmido con la misma enzima, los extremos encajan y la ADN ligasa los une: es el ADN recombinante. Introducido en una bacteria (transformación), el plásmido se copia con ella y puede fabricar la proteína deseada.

En la práctica se usan genes marcadores en el plásmido (por ejemplo, resistencia a ampicilina) para seleccionar las bacterias que lo han incorporado: solo crecen en un medio con el antibiótico.

4. Problemas resueltos

Problema 1: ¿cuántas copias da una PCR?

Partiendo de una sola molécula de ADN, ¿cuántas copias hay tras 30 ciclos? ¿Y si se parte de 100 moléculas y se hacen 25 ciclos? Si cada ciclo dura 120 s, ¿cuánto tarda en total la primera?

$N = 1 \cdot 2^{30} = 1\,073\,741\,824 \approx 1{,}07 \cdot 10^{9} \qquad N = 100 \cdot 2^{25} = 3{,}36 \cdot 10^{9}$

$t = 30 \cdot 120\ \text{s} = 3600\ \text{s} = 1\ \text{h}$

Problema 2: tamaño de un fragmento

En un gel, el marcador da bandas de 1000, 500 y 250 pb a 18, 28 y 38 mm del pocillo. Una muestra tiene una banda a 33 mm. ¿Qué tamaño tiene? La relación entre $\log_{10}$(tamaño) y la distancia es lineal:

$\text{pendiente} = \frac{\log 250 - \log 1000}{38 - 18} = \frac{2{,}398 - 3}{20} = -0{,}0301\ \text{mm}^{-1}$

$\log(\text{tamaño}) = 3 - 0{,}0301\,(33 - 18) = 2{,}548 \;\Rightarrow\; \text{tamaño} = 10^{2{,}548} \approx 354\ \text{pb}$

Problema 3: cortar con EcoRI

La secuencia (una sola cadena, 48 pb) es ATGCCGAATTCTTAGGCATCGGAATTCAAGCTTACGGAATTCGATCGA. La EcoRI corta tras la G de GAATTC. ¿Cuántos sitios hay y qué tamaño tienen los fragmentos?

Buscando GAATTC aparece en tres posiciones, por lo que se obtienen cuatro fragmentos:

$\text{tamaños: } 6,\ 16,\ 15,\ 11\ \text{pb} \qquad \text{(suma} = 48\ \text{pb)}$

Regla general: $n$ cortes en un ADN lineal producen $n + 1$ fragmentos; si el ADN es circular (como un plásmido), $n$ cortes producen $n$ fragmentos.

Problema 4: temperatura de anillamiento

Una fórmula sencilla para la temperatura de fusión de un cebador corto es $T_m = 4\,(G + C) + 2\,(A + T)$. Calcúlala para el cebador ATGCGTACGGTAGCCTAGGC y estima la temperatura de anillamiento (unos 5 °C menos).

El cebador tiene 20 bases: 12 son G o C y 8 son A o T.

$T_m = 4 \cdot 12 + 2 \cdot 8 = 64\ ^{\circ}\text{C} \;\Rightarrow\; T_{\text{anillamiento}} \approx 59\ ^{\circ}\text{C}$

Cuantas más G y C tiene un cebador, más alta es su $T_m$, porque G–C se unen con tres puentes de hidrógeno y A–T con dos.

Problema 5: eficiencia de transformación

Se transforman bacterias con 10 ng de plásmido y tras sembrar crecen 300 colonias en un medio con antibiótico. ¿Cuál es la eficiencia de transformación?

$\frac{300\ \text{colonias}}{10\ \text{ng}} = 30\ \text{colonias/ng} = 3 \cdot 10^{4}\ \text{colonias/}\mu\text{g}$

Cada colonia procede de una bacteria que incorporó el plásmido (y su gen de resistencia), por lo que el número de colonias mide los transformantes.

5. Errores frecuentes

• ⚠️ Pensar que la PCR copia todo el ADN de la muestra. Solo se amplifica el fragmento comprendido entre los dos cebadores
• ⚠️ Creer que cada ciclo suma una copia. Cada ciclo duplica: se multiplica por 2, no se suma 1
• ⚠️ Pensar que en la electroforesis los fragmentos grandes llegan más lejos. Los más pequeños migran más deprisa y recorren más distancia
• ⚠️ Confundir el número de cortes con el de fragmentos. En ADN lineal, $n$ cortes dan $n + 1$ fragmentos; en circular, $n$
• ⚠️ Olvidar que la polimerasa de la PCR es termoestable. Si no resistiera los 94 °C, se desnaturalizaría en el primer ciclo

6. 📌 En 30 segundos

1. PCR: desnaturalización (94 °C), anillamiento (≈ 55 °C) y extensión (72 °C); tras $n$ ciclos hay $2^n$ copias.
2. Electroforesis: el ADN (carga −) migra hacia el polo +; los fragmentos pequeños llegan más lejos.
3. Enzimas de restricción cortan en secuencias palindrómicas; la ADN ligasa une los fragmentos.
4. ADN recombinante: gen + plásmido cortados con la misma enzima → transformación → selección con antibiótico.
5. $T_m \approx 4\,(G + C) + 2\,(A + T)$ para cebadores cortos.

Para seguir estudiando

• ADN, ARN y flujo de la información genética
• ¿Cómo actúa un enzima?
• Genética mendeliana: leyes de Mendel y problemas resueltos